Mutacje somatyczne kalretikuliny w nowotworach mieloproliferacyjnych AD 10

Nieumożliwiający CALR kolokalizuje się z kalsykiną w retikulum endoplazmatycznym (połączenie w kolorze żółtym). Jednak zmutowany CALR nie jest ograniczony w retikulum endoplazmatycznym. Jądro jest wybarwione na niebiesko (4 , 6-diamidino-2-fenylidol [DAPI]). Aby zbadać funkcjonalne efekty zmutowanego CALR, sklonowaliśmy komplementarny DNA (cDNA) niezmutowanego CALR i mutacji typu (delecja 52-bp) do retrowirusowego wektora ekspresyjnego opartego na wirusie mysich komórek macierzystych, z wewnętrznym rybosomem miejsce wejścia i zielone białko fluorescencyjne (GFP). Po retrowirusowej produkcji i transfekcji cDNA CALR do zależnej od interleukiny-mysiej linii komórkowej Ba / F3, sortowaliśmy komórki wykazujące ekspresję transgenu za pomocą cytometrii przepływowej dla GFP (ryc. S6 w Dodatku Aneks). Następnie zmierzyliśmy zależną od interleukiny 3 proliferację komórek. Komórki wyrażające mutację CALR typu wykazywały wzrost, który był niezależny od interleukiny-3, a także wykazywał nadwrażliwość na interleukinę-3 (Figura 5A). Gdy zmierzono proliferację komórek pod nieobecność interleukiny-3, tylko mutacja CALR typu wykazała znaczną akumulację komórek (Figura 5B).
Aby zbadać, czy niezależność od interleukiny-3 w komórkach zmutowanych typu CALR została spowodowana przez aktywację przekaźnika sygnału JAK i aktywatora sygnalizacji transkrypcji (JAK-STAT), określiliśmy wrażliwość komórek na inhibitor kinazy JAK2 SAR302503. Komórki wyrażające niezmutowane CALR lub mutację CALR typu wykazywały podobną wrażliwość na SAR302503, co sugeruje, że niezależny od interleukiny-3 wzrost zmutowanych komórek CALR zależy od JAK2 lub kinazy z rodziny JAK, na którą ukierunkowany jest SAR302503 (Fig. S7 w Dodatku Dodatek).
Aby potwierdzić tę hipotezę, zbadaliśmy fosforylację STAT5 w obecności i nieobecności interleukiny-3 w liniach komórkowych kontrolnych i transfekowanych CALR. Wykryliśmy zwiększoną fosforylację STAT5 w nieobecności interleukiny-3 w mutacji typu CALR i przy stężeniu interleukiny-3 0,1 ng na mililitr (Figura 5C). Zatem zwiększona aktywacja sygnalizacji JAK-STAT prawdopodobnie odpowiada za niezależny od cytokin wzrost komórek wyrażających mutację CALR typu 1.
Do określenia lokalizacji komórkowej niezmutowanej i CALR zmutowanej typu zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną. W przypadku nadekspresji w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK), nieumożliwiający CALR kolokalizowano z retikulum endoplazmatycznym (barwionym kumeksynem). W przypadku CALR typu 1, ta kolokalizacja była jednak mniej znacząca, prawdopodobnie z powodu braku C-końcowej sekwencji KDEL zmutowanego CALR (Figura 5D).
Dyskusja
Zidentyfikowaliśmy mutacje somatyczne w CALR u pacjentów z pierwotną mielofibrozą lub nadpłytkowością samoistną
[podobne: fitamina, osteopatia Warszawa, polcortolon ]

Powiązane tematy z artykułem: fitamina osteopatia Warszawa polcortolon